Der apikale Zilienadhäsionskomplex wird am basalen Fuß der beweglichen Zilien gebildet und hängt vom Mikrotubuli-Netzwerk ab

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 19028 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Der Zilienadhäsionskomplex (CA) bildet sich in enger Verbindung mit den Basalkörpern der Zilien in den frühen Stadien der Ziliogenese und ist für die Vermittlung komplexer Wechselwirkungen mit den Aktinnetzwerken multizilierter Zellen (MCCs) verantwortlich. Seine genaue Lokalisierung in Bezug auf die akzessorischen Basalkörperstrukturen und die Wechselwirkungen, die zu seiner Etablierung in MCCs führen, sind jedoch nicht genau verstanden. Hier untersuchten wir die Verteilung der CA-Proteine ​​mithilfe hochauflösender Bildgebung und mögliche Wechselwirkungen mit dem Mikrotubuli-Netzwerk. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass sich der apikale CA-Komplex am distalen Ende des Basalfußes bildet und von Mikrotubuli abhängt. Unsere Daten lassen auch darauf schließen, dass CAs möglicherweise zusätzliche Rollen bei der Regulierung der Organisation des Mikrotubuli-Netzwerks von MCCs spielen.

Zilien sind auf Mikrotubuli basierende Vorsprünge und werden in primäre und bewegliche Zilien eingeteilt, die sich in Struktur und Funktion unterscheiden1, 2. Die meisten Zellen entwickeln ein einzelnes, nicht bewegliches primäres Zilien zur Wahrnehmung und Übertragung mechanischer und chemischer Signale. Bewegliche Zilien hingegen schlagen koordiniert und polarisiert, um einen Flüssigkeitsfluss zu erzeugen. Beispielsweise enthalten multizilierte Zellen (MCCs) Hunderte beweglicher Flimmerhärchen, die den Liquorfluss im Gehirn und den Eizellentransport entlang des Eileiters steuern. Außerdem werden sie in den Atemwegen für die Beseitigung von Schleim benötigt, der eingeatmete Partikel und Krankheitserreger einfängt. Daher führen Defekte des durch Zilien erzeugten Flüssigkeitsflusses zu einem erhöhten Risiko für Hydrozephalus und weibliche Unfruchtbarkeit sowie chronisch wiederkehrende Atemwegsinfektionen und führen zu Krankheiten wie der primären Ziliardyskinesie (PCD)3,4,5.

Zilien werden aus Basalkörpern (BBs) zusammengesetzt, bei denen es sich um neunfach symmetrische Strukturen auf der Basis von Mikrotubuli (MT) handelt. In MCCs sind BBs polarisiert, wobei die Basalfüße in Richtung des Ziliarflusses ragen. Der Verlust des Basalfußes führt zu einer Desorientierung der Zilien6. Der Basalfuß fungiert als MT-Organisationszentrum und seine Proteine ​​sind in drei Strukturregionen organisiert: Region I verbindet den Basalfuß mit den Mikrotubuli-Tripletts des Basalkörpers und sorgt wahrscheinlich für mechanische Unterstützung bei einem effektiven Schlaganfall6, 7; Region II oder Gerüstregion besteht aus Proteinen, die beim Aufbau des Basalfußes dienen, wie z. B. ODF26, 8, 9, Ninein10, Galactin-37, CEP1911, CEP12812, Centriolin13 und CC2D2A14; Region III oder Mikrotubuli-verankernde Region entspricht der basalen Fußkappe, die aus einem Proteinkomplex besteht, der Mikrotubuli verankert oder keimt. Insbesondere bei beweglichen Zilien enthält die Kappe neben anderen Proteinen NEDD1 und γ-Tubulin, die den γTuRC-Komplex entwickeln, der für die Mikrotubuli-Keimbildung notwendig ist15. CEP170 ist ein Protein der Basalfußkappe, das für die Verbindung der Basalkörperchen mit dem Mikrotubuli-Netzwerk16, 17 erforderlich ist. Darüber hinaus lokalisieren sowohl Z- als auch ε-Tubulin an der Basalfußkappe in MCCs18. Interessanterweise unterbricht die Erschöpfung von Z-Tubulin nicht die Verbindung des MT-Netzwerks zum Basalfuß, sondern stört den Aufbau der apikalen und subapikalen Aktinnetzwerke, was darauf hindeutet, dass der Basalfuß die Interaktionen des Basalkörpers mit dem Aktin-Zytoskelett vermittelt18.

Die embryonale Epidermis von Xenopus laevis verfügt über eine Reihe von MCCs, die ein ideales Modell für die Untersuchung der Entwicklung und Funktion von Zilien darstellen. Unsere früheren Arbeiten mit Xenopus laevis führten zur Entdeckung einer neuartigen Zilienstruktur, die als Zilienadhäsionen (CAs) bezeichnet wird19. CAs sind Multiproteinkomplexe, die mit den Basalkörpern von Zilien assoziieren und an den Wechselwirkungen zwischen Basalkörpern und dem Aktin-Zytoskelett während der MCC-Differenzierung sowie bei reifen MCCs beteiligt sind. Vier Proteinmitglieder des CA-Komplexes wurden identifiziert: FAK, Paxillin, Vinculin und Talin; Alle sind gut charakterisierte Mitglieder des Multiproteinkomplexes Fokale Adhäsion (FA). CAs bilden sich in zwei unterschiedlichen Regionen subapikal am Ende der quergestreiften Wurzel und apikal neben den Basalkörpern, ihre genaue Positionierung in Bezug auf die Zusatzstrukturen der Basalkörper bleibt jedoch unerforscht. In der vorliegenden Studie führten wir eine detailliertere Lokalisierungsanalyse von CA-Proteinen mithilfe hochauflösender Mikroskopie durch, um die Bildauflösung zu erhöhen und die Lokalisierungsgenauigkeit zu verbessern. Die subziliare CA-Positionierung wurde anhand der proximalen und distalen Marker des Basalfußes bestimmt. Wir haben daher CA-Mitglieder als basale Fußproteine ​​identifiziert, was zukünftige Untersuchungen zur Rolle basaler Fußkomponenten in der Biologie der Zilien unterstützen wird.

Basierend auf unseren früheren Beobachtungen ist das CA-Signal neben den Basalkörperchen und gegenüber den Wurzeln konzentriert, ungefähr in dem Bereich, in dem sich der Basalfuß bildet, und an einer Stelle, an der elektronenmikroskopische Analysen Wechselwirkungen zwischen Basalkörpern und dem Aktin-Zytoskelett identifizierten20. Da die TEM-Analyse bestätigte, dass der Basalfuß in reifen MCCs direkt mit kortikalen Mikrotubuli interagiert17, analysierten wir zunächst die Lokalisierung des CA-Proteins FAK in Bezug auf das apikale Mikrotubuli-Netzwerk in epidermalen Xenopus-MCCs. Die vollständige Immunfärbung von Xenopus-Embryonen mit einem Antikörper gegen β-Tubulin führte zu einer starken Färbung der Zilien, was unsere Fähigkeit beeinträchtigte, das intrazelluläre MT-Netzwerk in reifen MCCs abzubilden. Um dies zu überwinden, wurde eine Deziliationsstrategie eingesetzt, um Zilien-assoziierte Signale zu eliminieren und die Visualisierung intrazellulärer MTs zu erleichtern. Mit GFP-FAK/RFP-Centrin injizierte Embryonen wurden mit Calciumchlorid (CaCl2), einem bekannten deziliierenden Mittel, 1 Minute lang deziliiert und mit eiskaltem Methanol fixiert, dem einzigen getesteten Fixiermittel, das die apikale CA-Lokalisation bewahrte und ein ähnliches Muster beibehielt zu dem, was durch Live-Bildgebung gewonnen wurde. Die Aldehyd-basierte Fixierung von CA-Komponenten erzeugt Artefakte, wobei sich der Großteil des Signals von CA-Proteinen auf die quergestreifte Wurzel konzentriert (Abb. S1). Wie in Abb. 1A gezeigt, überlappt das FAK-Signal mit β-Tubulin, was auf eine teilweise Kolokalisierung des CA-Komplexes mit dem Mikrotubuli-Netzwerk hinweist. Um die Möglichkeit zu untersuchen, dass die Etablierung des CA-Komplexes von Wechselwirkungen mit dem apikalen Mikrotubuli-Netzwerk abhängen könnte, wurden GFP-FAK/RFP-Centrin-Embryonen ab Stadium 23–29 mit 1 μΜ Nocodazol behandelt, von dem zuvor gezeigt wurde, dass es das hochgradige Mikrotubuli-Netzwerk stört organisiertes apikales Mikrotubuli-Netzwerk in MCCs21. Interessanterweise beeinflusst die Behandlung mit Nocodazol die CA-Lokalisierung von FAK und ihre Assoziation mit den Basalkörperchen deutlich (Abb. 1B). Dies legt nahe, dass die FAK-Rekrutierung in CAs zumindest teilweise vom apikalen Mikrotubuli-Netzwerk abhängt. Darüber hinaus wird die Position des FAK-Signals in Bezug auf das BB in mit Nocodazol behandelten Embryonen beeinflusst (Abb. 1B). Dies kann auf strukturelle Veränderungen des BF hinweisen, auf dem sich CAs bilden, oder auf eine Neupositionierung des CA auf dieser Struktur.

CAs assoziieren mit Mikrotubuli. (A) Co-Expression von RFP-Centrin und GFP-FAK, gefolgt von β-Tubulin-Färbung in deziliierten MCCs. GFP-FAK ist teilweise mit Mikrotubuli kolokalisiert. Maßstabsbalken, 5 µm. (B) Embryonen, denen RFP-Centrin und GFP-FAK injiziert wurden, wurden ab Stadium 23–29 mit 0,1 % DMSO oder 1 μΜ Nocodazol behandelt. Die GFP-FAK-CA-Lokalisierung wird durch die Behandlung mit Nocodazol beeinträchtigt.

Angesichts der Nähe von CAs zu BFs und BBs haben wir beschlossen, die genaue Position von CAs innerhalb der BF-Struktur abzubilden. Allerdings fehlt die molekulare Architektur des Basalfußes in den beweglichen Zilien von Gal3) und der distalen Region (GFP-CEP170, mCherry z-Tubulin, mOrange γ-Tubulin) des Basalfußes bei Säugetieren, um mithilfe hochauflösender Mikroskopie eine Karte des Xenopus-Basalfußes zu erstellen (Abb. 2A). Wir haben die meisten der gemeldeten Basalfußproteine ​​in Kombination mit mTagBFP2 Centrin abgebildet, das als Marker für Basalkörper dient, und die Proteinpositionen relativ zur Mitte des Basalkörpers quantitativ kartiert (Abb. 2B). Die mRNA von basalen Fußmarkern wurde zusammen mit Centrin-mRNA über gezielte Mikroinjektionen in die ventralen Blastomeren von Embryonen im 4-Zellen-Stadium eingeführt. Die Basalfußregion-II-Komponenten CEP128, ODF2 und CEP19 zeigten ähnliche Abstände vom Basalkörperzentrum. Ähnlich wie menschliche primäre Zilien befindet sich Gal3 in der Brückenregion zwischen den Regionen II und III, während Zeta- und γ-Tubulin am weitesten vom Basalkörperzentrum entfernt sind, was im Einklang mit ihrer Assoziation mit MTs steht. Die Verteilung von CEP170 in unmittelbarer Nähe der Region III des Basalfußes steht im Einklang mit seiner Fähigkeit, MTs22 zu binden. Insgesamt zeigten unsere Daten, dass die Verteilung der basalen Fußproteine ​​in Xenopus-MCCs mit den zuvor berichteten Positionen in menschlichen beweglichen Zilien übereinstimmt15.

Kartierung basaler Fußproteine ​​in beweglichen Zilien von Xenopus. (A) (i) Optischer Abschnitt einer multizilierten Zelle, die mTagBFP2-Centrin und GFP-CEP128 exprimiert. (ii) Optischer Abschnitt einer multizilierten Zelle, die mTagBFP2-Centrin und GFP-ODF2 exprimiert. (iii) Optischer Schnitt einer multizilierten Zelle, die mTagBFP2-Centrin exprimiert und mit einem Antikörper gegen CEP19 gefärbt ist. (iv) Optischer Abschnitt einer multizilierten Zelle, die mTagBFP2-Centrin und GFP-Gal3 exprimiert. (v) Optischer Schnitt einer multizilierten Zelle, die mTagBFP2-Centrin und mCherry z-Tubulin exprimiert. (vi) Optischer Schnitt einer multizilierten Zelle, die mTagBFP2-Centrin und mOrange γ-Tubulin exprimiert. (vii) Optischer Abschnitt einer multizilierten Zelle, die mTagBFP2-Centrin und GFP-CEP170 exprimiert. Maßstabsbalken repräsentieren 5 μm. (B) Boxdiagramm der Abstandsmessungen basaler Fußproteine ​​in epidermalen MCCs in Xenopus. CEP128, ODF2 und CEP19 befinden sich in Region II und zeigten ähnliche Abstände vom Basalkörper, Gal3 befindet sich in der Brückenregion zwischen Region II und Region III, während γ-Tubulin, z-Tubulin und CEP170 in der distalen Region III von lokalisiert sind der Basalfuß.

Anhand dieser hochauflösenden Karte als Leitfaden untersuchten wir als nächstes die CA-Lokalisierung in Bezug auf Proteine, die der proximalen Region des Basalfußes zugeordnet wurden. Die Analyse der relativen Verteilung von GFP-ODF2 und GFP-128 in der Live-Bildgebung einzelner Basalkörper von MCCs ergab, dass keiner dieser Basalfußmarker der Region II zusammen mit mKate2-FAK lokalisiert war (Abb. 3A). Seitenansichten und Intensitätsprofile des vergrößerten Ausschnitts zeigen deutliche Spitzen der Fluoreszenzsignale.

FAK ist am distalen Ende des Basalfußes lokalisiert. (A) (i) Konfokaler optischer Abschnitt einer multizilierten Zelle, die GFP-CEP128, mKate2-FAK und mTagBFP2-Centrin exprimiert. Hochvergrößerte Ansicht eines repräsentativen Basalkörpers und orthogonale (x–z) Bildstapel einer Vielzilienzelle, die zeigt, dass FAK in Bezug auf BB weiter distal lokalisiert ist als CEP128. (ii) Konfokaler optischer Abschnitt einer multizilierten Zelle, die GFP-ODF2, mKate2-FAK und mTagBFP2-Centrin exprimiert. Rechts: Es werden die stark vergrößerte Ansicht eines repräsentativen Basalkörpers und orthogonale (x–z) Bildstapel einer Vielzilienzelle gezeigt. (iii) Immunfluoreszenzfärbung von endogenem CEP19 in RFP-Centrin/GFP-FAK exprimierenden multizilierten Zellen. FAK ist in Bezug auf den BB weiter distal lokalisiert als CEP19. (iv) Optischer Abschnitt einer multizilierten Zelle, die GFP-Gal3, mKate2-FAK und mTagBFP2-Centrin exprimiert. Draufsicht und orthogonale Projektion (x–z), die zeigen, dass FAK in Bezug auf BB weiter distal lokalisiert ist als der Brückenregionsmarker Gal3. Maßstabsbalken repräsentieren 5 μm. (B) (i) Repräsentativer optischer Abschnitt einer multizilierten Zelle, die GFP-FAK, mOrange γ-Tubulin und mTagBFP2-Centrin exprimiert. FAK kolokalisiert teilweise mit γ-Tubulin. Draufsicht und orthogonale Projektion (x–z) werden angezeigt. (ii) Optischer Schnitt einer multizilierten Zelle, die GFP-FAK, mCherry z-Tubulin und mTagBFP2-Centrin exprimiert. Draufsicht und orthogonale Projektion (x–z) zeigen, dass FAK teilweise zusammen mit z-Tubulin lokalisiert ist. (iii) Repräsentativer optischer Abschnitt einer multizilierten Zelle, die GFP-CEP170 und mKate2-FAK exprimiert. Eine stärkere Draufsichtvergrößerung eines einzelnen Basalkörpers und eine orthogonale Projektion (x–z) zeigen, dass FAK zusammen mit CEP170 lokalisiert ist. Maßstabsbalken repräsentieren 5 μm. Korrelationskoeffizientendiagramm nach Pearson, das die Kolokalisierung von FAK mit z-Tubulin, γ-Tubulin und CEP170 darstellt. Höhere Werte weisen auf eine stärkere Co-Lokalisierung zwischen FAK und CEP170 hin. (C) Multizilierte Zelle, die GFP-CEP170 und mKate2-FAK exprimiert, vor und nach der Photobleichung des Akzeptors. Quantifizierung der Fluoreszenzintensität von Akzeptor (mKate2) und Donor (GFP) nach Photobleichung zeigt, dass FRET zwischen GFP und mKate2 stattfindet, was die räumliche Überlappung zwischen den beiden Proteinen bestätigt und die Möglichkeit erhöht, dass FAK mit CEP170 interagiert. Kontrollexperimente mit GFP-Centrin als Donor und mKate2-FAK als Akzeptor wurden durchgeführt, was darauf hindeutet, dass keine direkte Wechselwirkung zwischen Centrin und FAK besteht. Maßstabsbalken repräsentieren 10 μm.

Darüber hinaus deutete die Verteilungsanalyse von FAK in Bezug auf Centrin und CEP19 auf eine distalere Lokalisierung der CAs hin (Abb. 3A). Als nächstes untersuchten wir daher die Lokalisierung von FAK in Bezug auf Galectin-3, von dem gezeigt wurde, dass es eine breite Verteilung in primären Zilien aufweist, die sich bis zur Überbrückungsregion zwischen den Regionen II und III des Basalfußes erstreckt15. Fluoreszenzintensitätsprofile zeigten jedoch, dass sich FAK weiter distal zum Marker der Brückenregion befindet. Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass sich FAK weiter distal befindet als die bekannten Marker der proximalen Regionen des Basalfußes, was darauf hindeutet, dass sich der CA-Komplex in der distalen Region III bilden könnte.

Als nächstes untersuchten wir, ob der CA-Komplex am distalen Ende des Basalfußes in multizilierten Zellen der Kaulquappen-Epidermis etabliert ist. Wir analysierten die Verteilung von FAK relativ zum Mikrotubuli-Keimbildner γ-Tubulin, von dem bekannt ist, dass er in MCCs an der Basalfußkappe lokalisiert ist7, 23. Es wurde festgestellt, dass die Expression von GFP-FAK in MCCs teilweise mit γ-Tubulin überlappt, was mit unserem vorherigen übereinstimmt Daten deuten darauf hin, dass sich CA-Mitgliedsproteine ​​in der Nähe der basalen Fußkappe lokalisieren (Abb. 3B). Als nächstes analysierten wir die Verteilung von FAK im Verhältnis zu Centrin und z-Tubulin, einem weiteren Bestandteil der Basalfußkappe18. In ähnlicher Weise zeigen Fluoreszenzintensitätsprofile eine teilweise Co-Lokalisierung von Z-Tubulin und FAK, was bestätigt, dass CAs in unmittelbarer Nähe der basalen Fußkappe gebildet werden.

Um dies weiter zu untersuchen, exprimierten wir mKate2-FAK und GFP-CEP170, ein Protein in Region III16. Wie gezeigt, überlappt das Signal von FAK mit dem Signal von CEP170 (Abb. 3B). Tatsächlich weisen die beiden Signale im Vergleich zu allen anderen getesteten Markern einen höheren Kolokalisationskoeffizienten auf. Die obigen Daten zeigen, dass sich CAs in der Region III des Basalfußes bilden und die deutliche Kolokalisierung zwischen FAK und CEP170 die Möglichkeit einer Wechselwirkung zwischen den beiden erhöht. Um diese Möglichkeit zu untersuchen, exprimierten wir GFP-CEP170 (Donor) mit mKate2-FAK (Akzeptor) und führten Akzeptor-Photobleichexperimente durch, um die Möglichkeit eines intermolekularen Fluoreszenzresonanzenergietransfers (FRET) zu untersuchen. Diese Experimente zeigen, dass FRET zwischen GFP-CEP170 und mKate2-FAK in MCCs stattfindet (Abb. 3C). Kontrollexperimente mit Centrin-GFP als Donor und mKate2-FAK als Akzeptor konnten FRET nicht wie erwartet nachweisen und zeigen, dass FAK nicht mit Centrin interagiert. Wir kommen daher zu dem Schluss, dass der CA-Komplex am distalen Ende des Basalfußes in MCCs etabliert ist und möglicherweise von einer Interaktion zwischen FAK und CEP170 abhängt.

Die Lokalisierungsdaten ließen die Möglichkeit erkennen, dass CAs an der Bildung des Basalfußes in Xenopus-MCCs beteiligt sein könnten. Um dieser Möglichkeit zu begegnen, injizierten wir Xenopus-Embryonen ein zuvor charakterisiertes translatorisch blockierendes Morpholino (MO), um die FAK-Expression in multizilierten Zellen zu unterdrücken (Abb. S2). Wir untersuchten die Lokalisierung von Basalfußmarkern durch Co-Expression von fluoreszenzmarkiertem Z-Tubulin und Galectin-3, nachdem die Basalkörperorientierung etabliert wurde (Stadien 30–35). Wie gezeigt, ist der Basalfuß in FAK-Morphanten etabliert, da die Basalfußkappenkomponente Z-Tubulin und das proximale Basalfußprotein Galectin-3 noch vorhanden waren (Abb. 4A). Interessanterweise war der Abstand zwischen den proximalen und distalen Basalfußmarkierungen bei FAK-Morphanten im Vergleich zu Kontrollen größer, was darauf hindeutet, dass die Basalfußstruktur beeinträchtigt sein könnte, was zu längeren Strukturen führt (Abb. 4B).

FAK-Depletion führt zu Defekten im MCC-Mikrotubuli-Netzwerk. (A) GFP-Galectin 3 und mCherry z-Tubulin-exprimierende Kontroll- und FAK-Morphant-Multizilienzellen. Maßstabsbalken, 5 µm. (B) Quantifizierung des Abstands zwischen GFP-Galectin 3 und Z-Tubulin, die längere basale Fußstrukturen in FAK-Morphanten zeigt. Fehlerbalken stellen den Mittelwert ± SEM dar. (C) Das Mikrotubuli-Netzwerk in Kontroll- und FAK-Morpholino-injizierten multizilierten Zellen wurde mit einem Antikörper gegen β-Tubulin gefärbt. Konfokale Bilder von Embryonen im Stadium 35 zeigen Mikrotubuli-Netzwerkdefekte in FAK-Morphanten. Maßstabsbalken repräsentieren 10 μm. (D) Räumliche Intensitätsvariation des β-Tubulin-Fluoreszenzsignals in Kontrolle und FAK MO MCC. Die Analyse wurde durch Messung der Fluoreszenzintensität in mehreren ROIs innerhalb einzelner MCCs durchgeführt (3 Kontroll- und 3 FAK-MO-Embryonen wurden für die Messungen verwendet). Fehlerbalken stellen den Mittelwert ± SEM dar.

Die teilweise Co-Lokalisierung der CAs mit der basalen Fußkappe, die als Mikrotubuli-Organisationszentrum (MTOC) fungiert und an der Mikrotubuli-Keimbildung und/oder -Stabilisierung beteiligt ist, erhöht die Möglichkeit, dass CAs an diesen Prozessen beteiligt sein könnten. Daher haben wir auch das apikale Mikrotubuli-Netzwerk in FAK-Morphanten analysiert. Die Abreicherung von FAK in MCCs führt zu einer schweren Störung des apikalen Mikrotubuli-Netzwerks (Abb. 4C, D). Wir können jedoch nicht ausschließen, dass dies ein sekundärer Effekt der bei FAK-Morphanten beobachteten Andockdefekte des Basalkörpers ist.

Insgesamt deuten die obigen Daten darauf hin, dass sich die FAK-Herunterregulierung aufgrund der Veränderungen in der räumlichen Beziehung von Gal3 und z-Tubulin auf die Struktur des Basalfußes auswirkt und schwerwiegende Defekte des apikalen Mikrotubuli-Netzwerks hervorruft, die jedoch sekundär zum Versagen der Basalkörper beim Andocken sein könnten .

Die CA-Mitglieder FAK und Paxillin zeigten eine signifikante, aber nicht perfekte Kolokalisierung (Abb. S3A). Die enge räumliche Beziehung zwischen CAs und CEP170 sowie die mögliche Interaktion zwischen CA-Mitgliedern und diesem Protein lassen darauf schließen, dass CEP170 Interaktionen zwischen BBs und CA-Proteinen vermittelt. Da FAK während der Basalkörpermigration19 vorhanden ist, haben wir die zeitliche Beziehung zwischen FAK, Paxillin und CEP170 im Hinblick auf ihre Assoziation mit den BBs untersucht. Wie in Abb. 5A gezeigt, ist CEP170 während der Interkalation von Flimmerzellen mit den durch mTag-BFP2-Centrin markierten Basalkörperchen ab Stadium 16 assoziiert. In diesem Stadium, in dem die radiale Interkalation von MCCs beginnt, wurde FAK nur schwach nachgewiesen, obwohl CEP170 eindeutig mit den Basalkörpern assoziiert war (Abb. 5B). Im Stadium 18, wenn Zentriolen beginnen, zur apikalen Oberfläche zu wandern, kolokalisiert FAK mit CEP170 und ist eng mit den Basalkörpern verbunden. Im Stadium 20, als die Zellen mit der Ziliogenese beginnen, war FAK in der Nähe reifer Basalkörperchen sichtbar, die an der apikalen Oberfläche angedockt waren. Anschließend verglichen wir die zeitliche Assoziationskinetik von FAK mit der von Paxillin (Abb. 5C). Die Korrelationskoeffizientenanalyse von Pearson zeigt, dass Paxillin im Gegensatz zu FAK zu den frühesten Zeitpunkten im Stadium 16 eindeutig mit den BBs assoziiert ist, ähnlich wie bei CEP170 (Abb. 5D). Dies deutet darauf hin, dass Paxillin möglicherweise über CEP170 an den BBs rekrutiert wird und anschließend FAK rekrutiert, um den CA-Komplex zu bilden. Dies stimmt mit früheren Daten überein, die zeigen, dass FAK für die CA-Lokalisierung auf seiner Interaktion mit Paxillin beruht. Anschließend untersuchten wir die Möglichkeit einer direkten Wechselwirkung zwischen CEP170 und Paxillin durch Immunpräzipitationsexperimente unter Verwendung von exogen exprimiertem GFP-CEP170 und mScarlet-Paxillin in HEK 293 T-Zellen. Wie in Abb. S3B gezeigt, besteht eine klare Wechselwirkung zwischen den beiden Proteinen, was die Rolle von CEP170 bei der Etablierung von CAs zusätzlich unterstützt. Zukünftige Arbeiten werden sich auf die Rolle von CEP170 bei der Etablierung des apikalen CA-Komplexes konzentrieren.

Hierarchische Assoziation von CEP170 und FAK mit Basalkörpern. (A) Konfokale Bilder interkalierender Flimmerzellen von Xenopus-Embryonen im Stadium 17, die mTag-BFP2-Centrin und GFP-CEP170 koexprimieren, zeigen, dass CEP170 in den frühen Stadien der MCC-Entwicklung mit Basalkörperchen assoziiert ist. Maßstabsbalken repräsentieren 5 μm. (B) Interkalierende Flimmerzellen von Xenopus-Embryonen, die mTag-BFP2-Centrin, mKate2-FAK und GFP-CEP170 koexprimieren. Embryonen wurden in den angegebenen Stadien abgebildet. CEP170 wird im Stadium 16 mit den Basalkörperchen assoziiert, wohingegen eine klare Assoziation von FAK im Stadium 18 nachweisbar wird. Maßstabsbalken repräsentieren 5 μm. (C) Interkalierende Flimmerzellen von Xenopus-Embryonen, die mTag-BFP2-Centrin, mKate2-FAK und GFP-Paxillin koexprimieren, was zeigt, dass Paxillin im Gegensatz zu FAK im Stadium 16 eindeutig mit Basalkörperchen assoziiert ist. Embryonen wurden in den angegebenen Stadien abgebildet. Maßstabsbalken repräsentieren 5 μm. (D) Korrelationskoeffizientendiagramme nach Pearson, die die Kolokalisierung von mKate2-FAK, GFP-CEP170 und GFP-Paxillin mit mTagBFP2-Centrin im Stadium 16 darstellen. Paxillin und CEP170 weisen mit Centrin im Vergleich zu FAK einen höheren Kolokalisierungskoeffizienten auf. Fehlerbalken stellen den Mittelwert ± SEM dar.

Wir haben zuvor eine neuartige Rolle von FAK als Mitglied von CA-Komplexen in epidermalen MCCs von Xenopus identifiziert . Der Verlust von FAK in diesen Zellen führt zu einer beeinträchtigten Ciliogenese aufgrund einer fehlerhaften Assoziation der Basalkörperchen mit dem Aktin-Zytoskelett. In MCCs befinden sich CAs hinter den Basalkörpern, bezogen auf die AP-Achse der Kaulquappe, wo sich der Basalfuß befindet, dessen genaue Lokalisierung jedoch nicht bekannt war. Mithilfe der hochauflösenden Mikroskopie konnten wir die Lokalisierung von FAK mit der von BF-Markern vergleichen und die Region, in der sich apikale CAs bilden, mit hoher räumlicher Auflösung definieren. Wir fanden heraus, dass FAK in der Nähe der basalen Fußkappe lokalisiert ist (Abb. 6). Genauer gesagt fanden wir heraus, dass FAK und das Region-III-assoziierte Protein CEP170 räumlich überlappen und einen sehr hohen Kolokalisationskoeffizienten aufweisen. Dies zeigt, dass sich apikale CAs im Bereich III des Basalfußes bilden.

CA-Lokalisation im distalen Bereich des Basalfußes. Cartoon-Darstellung der CA-Lokalisierung im distalen Bereich des Basalfußes. Basale Fußkomponenten sind in räumlich getrennten Regionen mit unterschiedlichen Funktionen organisiert (Region I, Basalkörperverankerung; Region II, Gerüst; Region III, MT-Verankerung).

Die Lokalisierung von FAK im CA-Komplex hängt stark von der FAT-Domäne und ihrer Wechselwirkung mit Paxillin ab, ähnlich wie die Lokalisierung von FAK an FAs. Tatsächlich kann die FAK I936E/I998E-Mutante, die kein Paxillin bindet, nicht an CAs rekrutiert werden und FAK-Morphanten können nicht gerettet werden, was zeigt, dass die Interaktion mit Paxillin sowohl für die Lokalisierung als auch für die Funktion erforderlich ist26. In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen beobachteten wir, dass Paxillin offenbar früher als FAK mit Basalkörperchen in multizilierten Zellen assoziiert ist. Interessanterweise ist CEP170 auch in frühen Stadien mit den BBs assoziiert, ähnlich wie Paxillin, was die Möglichkeit erhöht, dass Paxillin am Basalfuß von CEP170 rekrutiert wird und anschließend FAK rekrutiert, um den CA-Komplex zu bilden.

Der Verlust des Basalfußes führt bei Mäusen zu Atembeschwerden, die auf PCD hinweisen. Bei trachealen MCCs führt der Verlust des Basalfußes zu einer Störung des apikalen Netzwerks der Mikrotubuli und zu einer Desorientierung der Basalkörper6. Die Lokalisierung von FAK an der basalen Fußkappe legt nahe, dass CAs möglicherweise an der Etablierung oder Aufrechterhaltung des apikalen Mikrotubuli-Netzwerks beteiligt sind. FAK-Morphanten weisen längere Basalfüße und ein verändertes Mikrotubuli-Netzwerk auf (Abb. 3), was darauf hindeutet, dass CAs möglicherweise eine Rolle bei der Regulierung der BF-Struktur spielen. Trotz der entscheidenden Rolle des Basalfußes für die Funktion multizilierter Zellen muss seine molekulare Organisation in Xenopus noch geklärt werden. Zusätzlich zur Definition der genauen Lokalisierung und Analyse der Rolle des CA-Proteins FAK stellen wir auch eine molekulare Karte bekannter basaler Fußkomponenten bereit (ODF2, CEP128, Galectin 3, CEP19, Ninein, CEP170, z-Tubulin und γ-Tubulin). in beweglichen Zilien von Xenopus. Mithilfe hochauflösender Bildgebung haben wir gezeigt, dass der Basalfuß in Xenopus-MCCs ein hohes Maß an Ähnlichkeit mit dem Basalfuß von multizilierten Zellen der menschlichen Atemwege aufweist15. Dieses hohe Maß an Erhaltung zwischen dem Menschen und dem Xenopus-Basalfuß bestätigt, dass Xenopus ein wertvolles Modellsystem für die Untersuchung beweglicher Zilien ist.

Bei weiblichen erwachsenen Xenopus laevis erfolgte der Eisprung durch Injektion von humanem Choriongonadotropin. Die Eier wurden in vitro befruchtet, in 1,8 % Cystein (pH 7,8) geliert und die Embryonen wurden in 0,1 × Marc's modifiziertem Ringer (MMR) gehalten und gemäß Nieuwkoop und Faber ins Stadium gebracht. Mikroinjektionen wurden in 4 % Ficoll in 0,33 × MMR an den ventralen Blastomeren von Embryonen im 4- oder 8-Zellen-Stadium durchgeführt, um auf die Epidermis abzuzielen. Für MO-Experimente injizierten wir 12 ng des FAK-Morpholinos pro Blastomer (bei Embryonen im 8-Zellen-Stadium). Für die Live-Bildgebung wurden Embryonen in 0,01 % Benzocain in 0,1 × MMR anästhesiert und in Silikonfettvertiefungen auf Glasobjektträgern immobilisiert.

Erwachsene Xenopus laevis werden in Übereinstimmung mit den EU-Richtlinien und den Richtlinien der Veterinärdienste des Ministeriums für Landwirtschaft, natürliche Ressourcen und Umwelt der Regierung Zyperns gehalten. Xenopus laevis sind in unserer lizenzierten Einrichtung untergebracht (Lizenznummer CY.EXP.102 an der Universität Zypern). Alle Experimente und Versuchsprotokolle wurden vom Nationalen Komitee zum Schutz der für wissenschaftliche Zwecke verwendeten Tiere der Republik Zypern mit der Lizenz (CY/EXP/PR.L05/2022) genehmigt. Die Experimente wurden in Übereinstimmung mit den ARRIVE-Richtlinien (https://arriveguidelines.org) durchgeführt.

Plasmide wurden mit dem SP6- oder T7-mMessage-mMachine-Kit (Invitrogen) in mRNA transkribiert und für Mikroinjektionen verwendet. Die in unseren Experimenten verwendete Sequenz von FAK MO ist TTGGGTCCAGGTAAGCCGCAGCCA19, 26.

Den Embryonen wurde ermöglicht, sich bis zum entsprechenden Stadium zu entwickeln, und dann wurden sie live abgebildet oder 2 Stunden lang in Methanol bei -20 °C fixiert und nach und nach mit 75 % Methanol-25 % MEMFA (10X: 1 M MOPS, 20 mM EGTA, 10 mM MgSO4) rehydriert , 38 % Formaldehyd), 50 % Methanol-50 % MEMFA, 25 % Methanol-75 % MEMFA und 100 % MEMFA für jeweils 10 Minuten. Die Embryonen wurden dann mehrere Stunden lang bei Raumtemperatur in PBDT (1 × PBS + 0,5 % Triton X-100 + 1 % DMSO) permeabilisiert und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur in PBDT + 10 % Eselserum blockiert. Anschließend wurden Primärantikörper hinzugefügt (in Blocklösung). Die verwendeten Primärantikörper waren: β-Tubulin (Hybridoma), γ-Tubulin (Abcam) und CEP19 (Proteintech). Die Embryonen wurden in der Antikörperlösung über Nacht bei 4 °C inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Embryonen in PBDT gewaschen und dann in sekundären Antikörpern, verdünnt in der Blockierungslösung, 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Bildgebung wurde mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop Zeiss LSM 900 mit Airyscan-Bildgebungssystem durchgeführt. Die Bildverarbeitung und Kolokalisierungsanalyse wurde mit der Zeiss ZEN 2.3-Software durchgeführt.

FRET-Experimente wurden unter Verwendung eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops (Zeiss LSM 710) mit einer Plan-Apochromat 63 × /1,40 Oil DIC M27-Objektivlinse (Zeiss) durchgeführt. Ein 543-nm-Laser wurde für die Photobleichung des Akzeptors (mKate-FAK) innerhalb einer Region of Interest (ROI) verwendet. Ein Bild wurde als Kontrolle vor dem Bleichen aufgenommen und der ROI wurde innerhalb eines Bildes gebleicht. Für die FRET-Analyse wurde die Software Zeiss Zen 2010 verwendet.

HEK 293 T-Zellen (ATTC) wurden in DMEM, ergänzt mit 10 % FBS, gehalten. Die Transfektionen wurden mit Lipofectamine 2000 (Invitrogen) gemäß dem Protokoll des Herstellers durchgeführt.

Zur Immunpräzipitation wurden HEK 293 T-Zellen mit GFP-CEP170 und mScarlet Paxillin co-transfiziert. 24 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen mit eiskaltem Lysepuffer (50 mm Tris-HCl pH 7,5, 150 mm NaCl, 1 mm EDTA, 1 % NP-40), ergänzt mit Protease- und Phosphataseinhibitoren, lysiert. Zelllysate wurden mit GFP-Trap-Beads (Chromotek) inkubiert und die Mischung 2 Stunden lang bei 4 ° C unter kontinuierlichem Schütteln inkubiert. Die Perlen wurden durch Zentrifugation bei 2000 × g gesammelt, mit Lysepuffer gewaschen und in Laemmli-Puffer resuspendiert. Die Proben wurden für die Western-Blot-Analyse verwendet.

Die Proteine ​​wurden auf 8 % SDS-Polyacrylamidgelen laufen gelassen und auf Nitrozellulosemembranen geblottet. Die Blots wurden in 5 % Milch in PBST (1 × PBS und 0,1 % Tween 20) blockiert und dann mit den Primärantikörpern bei 4 °C inkubiert. Die verwendeten Primärantikörper waren: GFP (1:1000, Novus), FAK (1:1000 Proteintech), Paxillin (1:5000 BD Biosciences) und GAPDH (1:3000, SantaCruz). Die Membranen wurden vor der Antikörperinkubation geschnitten. Die Visualisierung erfolgte mit HRP-konjugierten Antikörpern (Santa Cruz) nach einstündiger Inkubation bei Raumtemperatur und ein Signal wurde mit dem ChemiDoc-Bildgebungssystem (Bio-Rad) nachgewiesen. Original-Blots werden in der Zusatzinformationsdatei angezeigt.

Die während der aktuellen Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind auf Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Wir danken Dr. Lotte Bang Pedersen für die freundliche Bereitstellung des GFP-CEP128-Plasmids.

Diese Arbeit wurde von der Research Promotion Foundation gefördert (EXCELLENCE/1216/1236 und EXCELLENCE/0918/0227).

Abteilung für Biowissenschaften, Universität Zypern, Postfach 20537, 2109, Nikosia, Zypern

Maria Chatzifrangkeskou & Paris A. Skourides

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MC führte die Experimente und Datenanalysen durch. MC und PAS haben das Manuskript geschrieben.

Korrespondenz mit Paris A. Skourides.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Chatzifrangkeskou, M., Skourides, PA Der apikale Zilienadhäsionskomplex wird am basalen Fuß der beweglichen Zilien gebildet und hängt vom Mikrotubuli-Netzwerk ab. Sci Rep 12, 19028 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-22871-0

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Eingegangen: 27. Juni 2022

Angenommen: 20. Oktober 2022

Veröffentlicht: 08. November 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-22871-0

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